主要作者单位：
医院（屈平华）
温医院（吴庆）
广医院（兰会华）
广州中医药大学级检验硕士（叶大柠）
1、弗朗西斯菌的分类介绍
弗朗西斯菌（Francisella）是一种兼性胞内寄生的革兰阴性球杆菌，属隶属于γ变形菌门的弗朗西斯菌科。最初，该菌属只包括土拉弗朗西斯菌（F.tularensis）、新凶手弗朗西斯菌（F.novicida）和蜃楼弗朗西斯菌（F.philomiragia）三个种；近几年来，陆续发现和命名了船城弗朗西斯菌（F.noatunensis）、杀鲍鱼弗朗西斯菌（F.halioticida）、西班牙弗朗西斯菌（F.hispanensis）和广州弗朗西斯菌（F.guangzhouensis）等多个菌种。最近，波斯沃尔巴克菌（Wolbachiapersica）亦重新分类为弗朗西斯菌属，更名为波斯弗朗西斯菌（F.persica）。目前，弗朗西斯菌属共包括8个合格发表的菌种，但存在一些已有临床感染报道的未分类菌株（表1）。
2、患者资料
患者，男，41岁，年8月1日于温州市鸥江入海口不慎溺水，发现时神志不清。4小时后，患者转入温医院急诊科，入院后，以经口气管插管接呼吸机辅助通气、泰能抗感染、甲强龙抗炎、氨茶碱平喘等进行综合治疗，症状有缓解。8月2日-4日，患者体温基本维持在37.6℃以下。
8月5日，患者诉咳嗽、痰量增多、痰较难咳出，伴体温升高；至8月11日，患者反复发热，最高体温达39.6℃，期间伴高热、畏寒和寒战。期间，胸水常规检查发现胸水混浊，有核细胞/ul，分叶核74%，淋巴22%，李凡他试验阳性；血常规：WBC14.01×/L，中性粒百分数0.↑C-反应蛋白90mg/L↑，PCT0.ng/ml↑，CT检查有胸腔积液，初步考虑溺水性细菌性肺炎和脓毒血症。予胸腔内引流积液和舒普森联合万古霉素经验性抗感染治疗，症状有缓解。8月12日，体温较前有下降。
8月14日，细菌室回报8月10日血培养厌氧瓶单次检出溶血葡萄球菌，对万古霉素敏感；故嘱加强拍背及辅助咳痰，继续舒普森和万古霉素抗感染治疗。8月17日，细菌室口头报告8月10日与8月11日血培养和胸水培养多次检出弗朗西斯菌。考虑到感染症状缓解，未更改用药方案，继续以舒普森和万古霉素抗感染治疗。8月18日，患者咳痰较前有改善；8月19日，患者体温略有波动，但稳定在38.0℃以下。8月20日，患者体温恢复正常。9月1日，患者恢复出院。
3、细菌培养和生长特性
胸水细菌培养在第3天出现云雾样菌落生长现象，第4天出现针尖样大小灰白色菌落，培养第7天第3区菌落可达1~2cm（见图1）。血培养分别在2.49、2.83和4.54天报警阳性，血培养阳性肉汤分纯后生长速度稍快，培养1天可见云雾样菌落生长现象，培养2天可见肉眼可见菌落。革兰染色为阴性多形性的球杆状和短杆状细菌（见图2）；氧化酶阴性，触酶弱阳性,与广州弗朗西斯（F.guangzhouensis）的形态特点相似。结合病原菌的菌落形态和患者鸥江入海口的溺水史，初步怀疑为一罕见的弗朗西斯菌溺水性肺炎。
图1:分离株血平板初次分离培养7天的菌形态图
图2:分离株革兰染色形态图（倍）
该分离株的培养基生长特性如下：在含L-胱氨酸的脑心浸液兔血琼脂平板上生长良好，二次分纯培养24h可形成灰绿色粘稠样α溶血菌落（见图3）。分离株在嗜血巧克平板上二次传代，培养48h形大小不一、直径约0.5-2cm菌落，出现灰白色不透明和浅灰色半透明两种明显不同的菌落形态（见图4），但多次传代后则均为巧克力平板上则均为灰白色不透明菌落。从生长状态来看，该菌在嗜血巧克平板上的生长状态明显优于血平板（见图5），但与嗜血杆菌所不同的是，V+X因子均为阴性（注：巧克力平板中的L-半氨酸对其生长起促进作用的关键因素）；另，该菌在麦康凯、普通MH平板等不生长；这些生长特性与广州弗朗西斯和蜃楼弗朗西斯菌相类似。
图3：含L-半胱氨酸脑心浸液血琼脂二次分纯培养24h菌落形态图
图4：嗜血巧克力平板二次分纯培养48h的菌落形态图
图5：分离株在血平板和嗜血巧克力平板二次分纯培养48h的菌落比较图
4生化和基因测序鉴定
采用16SrRNA基因，以及rpoB、mdh和sdhA三个管家基因进行测序鉴定，基因序列比对结果见表2。四个基因的序列分析显示（图6和图7），该菌与Francisellacf.novicida同源性最高，另与土拉弗朗西斯菌（F.tularensis）和新凶手弗朗西斯菌（F.novicida）的亲缘关系亦比较近。但管家基因序列和进化树，可初步排除土拉弗朗西斯菌（F.tularensis）和新凶手弗朗西斯菌（F.novicida）两个种。综合分析的结果认为，分离株与Francisellacf.novicida可能为同一个种。鉴于Francisellacf.novicida为分类学的定义未分类的暂定种（注：“cf.”为“暂定种弗朗西斯菌种”的缩写），故该分离株为弗朗西斯菌属的一个潜在新种，其正式的分类地位还有待于进一步的研究和正式定名。
图6：分离株的16SrRNA进化树
图7：分离株rpoB、mdh和sdhA三个管家基因合并的进化树
生化试验显示，该菌葡萄糖发酵阳性、果糖发酵阳性、麦芽糖发酵阳性、蔗糖发酵实验阳性、鸟氨酸脱羧酶阳性、脲酶阴性、脂酶阳性、碱性磷酸酶阳性、β-半乳糖苷酶阳性、脯氨酸芳氨酶阴性、γ-谷氨酰基转移酶阴性、吲哚试验阴性。但由于不在相应的数据库范围内，采用APINH鉴定条，生化编码为，将错误提示为副流感嗜血杆菌。而采用VitekNH卡，其生化编码为，将错误提示为空肠弯曲菌空肠亚种和尿道寡源菌。
5药敏试验
药敏试验采用K-B法和E-test法，培养基为自配含L-半胱氨酸的血MH平板。试验结果显示，该菌纸片法β-内酰酶实验阳性。由K-B法抑菌环直径来看，其对于青霉素、头孢唑啉、头孢吡肟、万古霉素和头孢哌酮/舒巴坦均耐药。按CLSIM45a-2土拉弗朗西斯菌的mic值判定标准，分离株对于庆大霉素、链霉素、四环素、强力霉素、左氧沙星、环丙沙星和氯霉素等均敏感（见表3）。
8：分离株K-B法部份药敏实验结果图
6毒力试验
采用皮下腹腔接种进行毒力实验的预实验，以0.5麦氏浊度的新鲜菌悬液0.5ml接种小鼠。结果显示，该菌具有一定的毒力，3只小鼠在接种4天内均死亡。初步估算，该菌的小鼠LD致死量在以下，与新凶手弗朗西斯菌相当。
7讨论
弗朗西斯菌广泛存在于海洋、咸水、土壤等自然生境中，模式菌种——土拉弗朗西斯菌土拉亚种（F.tularensissubsp.tularensis）的毒力最强，可以通过接触病畜、食入污染的食物、吸入污染动物皮毛、皮肤接触、昆虫叮咬、消化道摄入和空气气溶胶等多种方式传播给人类，被认为是一种潜在的生物武器。但需要指出的是，除拉弗朗西斯菌土拉亚种外，弗朗西斯菌属其他菌种的毒力和致病性较弱，主要在免疫力低下人群中引起感染。近年来的研究发现，弗朗西斯菌属的多个菌种具有嗜盐性。并且，随着诊断水平的提到，在一些近海或海岛地区，每年均有弗朗西斯的散发感染和水疫性爆发感染的报道，其中溺水（可引起肺炎和耳炎）、伤口感染和吸入气溶是最主要的感染方式。但在我国，由于对于该菌的认识水平较低，仅年杜文功和年王艳华等有两例临床报道。
本次报道的弗朗西斯菌，其溺水点位于温州市鸥江入海口，且在溺水后的第5天始出现脓毒血症症状，符合胞内菌感染和弗朗西斯菌溺水性肺炎感染的特点。并且，根据16SrRNA基因及三个管家基因rpoB、mdh、sdhA的基因序列比对结果，该菌与已知的拉弗朗西斯菌和西班牙弗朗西斯菌均存在较大的差异，但与Francisellacf.novicida非常接近，故初步认为与Francisellacf.novicida为同一个种。但鉴于“cf.”为“暂定种”，故其最终的分类学地位还有待于进一步的研究和正式确定。需要注意的是，由于弗朗西斯菌不在APINH和VitekNH数据库范围内，临床可能被错误鉴定，其初步鉴定需要有对弗朗西斯菌有较深的认识，而最终的鉴定则依赖于测序的手段。
药敏实验结果显示，该菌产β-内酰酶，对青霉素和头孢菌类耐药，但对于庆大霉素、链霉素、四环素、强力霉素、左氧沙星、环丙沙星和氯霉素等治疗土拉热病的药物均敏感。尽管CLSIM45a-2推荐MIC法进行药敏实验，但从我们的实验结果来看，K-B法抑菌环直径有利于药敏结果的的初步判定。然而，遗憾的是，临床医生未根据弗朗西斯菌的药敏情况更改用药。临床的胸腔内引流积液、雾化排痰则可能是患者恢复的主要原因。
目前，该分离株正在进一步的研究中，并且，根据其地理来源，拟初步命名为温州弗朗西斯菌（Francisellawenzhouensis）。如能取得命名优先权，那么，这将是继环境分离株广州弗朗西斯菌（Francisellaguangzhouensis）之后，另一个由中国本土命名的弗朗西斯菌新种。
8、主要参考文献
[1]屈平华,邓小玲,张健,等.一株弗兰西斯菌的鉴定及其微生物学特性研究.微生物学报.,49:-.
[2]QuPH,ChenSY,ScholzHC,etal.Francisellaguangzhouensissp.nov.,isolatedfromair-conditioningsystems.IntJSystEvolMicrobiol.,63:3-.
[3]杜文功,高元兰.从眼结膜炎及咽峡炎患儿血中分离出土拉热弗朗西氏菌.医学理论与实践.,7:44-45.
[4]王艳华,乔富宇,曹菊,等.中国土拉弗朗西斯菌B型亚种新亚型的发现与溯源分析[J].中华预防医学杂志,,49(11).
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