摘要
采用血浆DNA检测突变作为一种液态活检形式已被广泛应用。EGFRTM存在于约半数的EGFR-TKI获得性耐药的肺癌患者中。EGFR-TKI治疗过程中采用血浆DNA进行TM监测作为二次活检的替代方法的有效性尚未建立。本文是一项针对携带EGFRLR或19外显子缺失并进行EGFR-TKI治疗的NSCLC患者的前瞻性多中心观察研究，主要目的是确定对疾病进展的患者采用血浆DNA是否能够检测到TM。TM采用突变偏好PCR和淬灭探针（MBP-QP）法，这是一种灵敏且全自动的检测系统。本研究共入组来自日本7所医院的89位NSCLC患者，检测表明40%的PD患者的血浆DNA中存在TM。敏感性突变，例如LR和E19缺失，在40%的患者血浆DNA中检测到，TM或敏感性突变在62%的患者中检测到。TM在四个疾病分期（PD前，PD中，停用EGFR-TKI时及随后）的检出率分别为10%、19%、24%、27%。吸烟者、男性、拥有E19缺失的患者、出现新病变的患者血浆DNA中TM出现频率显著高于其他患者。MBP-QP法进行血浆DNATM监测反映了EGFR-TKI治疗的肺癌患者的临床过程。血浆DNATM检测与EGFR突变状态、E19缺失、肿瘤进展有关。二次活检只能在14%的PD患者中实施，这提示在临床实践中中获取二次活检样本存在困难。采用血浆DNA监测TM可以反映临床过程，并在制定后续治疗方案方面具有潜在的应用前景。
方法
研究人群：
Hanshin-SagaTM（HASAT）研究，是一项前瞻性多中心观察研究。患者来自于日本7家医院，时间为年2月1日到年2月29日期间。入组标准是通过组织或细胞学检查确定的NSCLC患者，具有E19缺失和LR，正计划或已经开始EGFR-TKI治疗。患者根据实体瘤反应评价标准（RECIST）具有可测量或不可测量的病灶。EGFR-TKI治疗前肿瘤组织或细胞中存在TM突变的患者不能入组。研究开始前，在商业化临床检测实验室SRL或Mitsubisi化学医学公司对EGFR突变状态进行了确认，包括TM状态，且均有医疗保险。检测方法分别是cyclavPCR技术和肽核酸锁定核酸PCR钳。
研究设计：
血浆TM检测采用MBP-QP法。血浆DNA中TM检测在EGFR-TKI治疗前和治疗开始后每4个月进行。胸部CT和肿瘤标志物每两个月进行检测。这些检测在疾病进展（PD）发现时、停用EGFR-TKI时、后化疗两个疗程后以及开始EGFR-TKI一个月后也均需要进行检测。要求有二次活检但非强制性。EGFR-TKI治疗前和PD时获取的组织标本采用MBP-QP法检测TM。PD期TM的检测标准是TM应该在PD前30天到后70天进行检测，考虑到血浆样本取材的间隔性。血浆中的激活性突变，例如E19缺失和LR分别用野生型抑制PCR和淬灭探针系统（WIP-QP）和MBP-QP法检测。
结果
患者特点
90例入组患者中，有1例因为缺乏可测量和不可测量的病灶而被排除。具有E19缺失和LR突变的患者数量相当。89个患者中，83%无EGFR-TKI资料史，剩余17%前期接受过EGFR-TKI治疗。尽管携带TM的癌症患者已被排除在外，TM仍在6.5%（5/77）的样本中通过MBP-QP复检到。由于2个患者在血浆样本取材前去世，因此分析了87例病患。一共58例患者疾病进展，其中23例在血浆DNA中检测到了TM。将患者分为两组，有或无EGFR-TKI治疗史，前者TM检出率为45%（5/11），后者为35%（18/47）。TM在29位非PD患者中检测出7例。EGFR-TKI治疗前采用MBP-QP进行肿瘤组织TM复检阳性率分别为5.9%（PD）和7.7%（非PD）。
血浆DNATM检测图谱
TM在40%（23/58）的PD患者中检测到（表1）。PD前、PD时、停用EGFR-TKI时和随后四个时期TM检出率分别为10%、19%、24%、27%。TM首次检测到是在PD前11个月到PD后9个月期间。激活性突变总阳性率为40%（35/87）；E19缺失检出率为41%（18/44），LR为40%（17/43）。在EGFR-TKI获得性耐药的患者中，22%为TM阳性和激活性突变同时存在，17%为只存在TM阳性，22%为只存在激活性突变，两种突变中存在一种突变的比例为62%。根据其他研究，EGFR-TKI获得性耐药的患者的二次活检组织TM可被检测到，但是激活性突变有时检测不到。这些结果提示获得性耐药后存在携带TM的肿瘤细胞克隆。PD患者的TM阳性图谱见图1。TM在16个患者中检测出1次，在7个患者中检测出2次或更多。前者中，TM主要在13个PD患者中检测出，对于7号患者，TM也在EGFR-TKI治疗前的肿瘤样本中通过MBP-QP检测出。由于突变等位基因的相对量可以通过突变峰下的面积计算得到，因此我们评估了突变量与临床过程的关系。TM被检测出两次或多次的样本中，突变峰下的面积通常是按照时间顺序递增。对比PD和非PD，突变等位基因的数量通常高于PD患者，28号患者除外。非PD患者中，TM在7个患者中检测到。TM在3例患者的随访期的末尾检测出阳性，且在30号患者中被反复检测到，TM也在原发灶检测到，这提示TM阳性克隆扩展了。
表1PD患者血浆DNATM检测情况
图1PD患者采用血浆DNA进行TM监测
血浆DNA和二次活检样本TM检测的一致性
我们获取了8例二次活检样本，包括3例患者的原发灶，3例患者的肺内转移灶以及2例患者的胸腔积液（表2）。TM分别在4例患者的二次活检样本和2例患者的血浆DNA中检测到。TM在两种样本中均阳性的患者，其二次活检取材于原发灶。仅二次活检TM阳性的样本一个来源于原发灶，两个来源于肺内转移灶。仅血浆DNA中TM阳性患者的样本来自于胸腔积液的二次活检。
表2血浆DNA和二次活检的一致性
PD患者的临床特点：对比TM阳性和阴性患者
TM更多的在男性、吸烟者以及E19缺失的患者中检测到（表3）。另外，TM更多的在新病灶出现时检测到，但在靶标病灶例如原发灶和/或淋巴结转移的纯粹恶化中出现较少。3例TM阳性PD患者展现出靶病灶的增加，其肝脏或肾上腺转移灶出现扩大。这些结果提示血浆DNA中TM检测与远端转移有关。对比TM阳性和阴性PD患者的总生存期（OS），后者OS显著高于前者（图2a）。血浆DNA中TM和激活性突变的联合分析表明，两者均阴性者比均阳性者或其一阳性者预后好（图2b）。
表3PD患者TM阳性和阴性对比
图2PD患者总生存期（OS）
（a）两组：TM阳性和阴性；（b）四组：TM阳性和激活性突变阳性；TM阳性和激活性突变阴性；TM阴性和激活性突变阳性；TM阴性和激活性突变阴性
讨论
本研究有如下发现：第一，采用MBP-QP进行血浆DNA中TM监测是可行的，且反映了EGFR-TKI治疗的LR或E19缺失的肺癌患者的临床过程。第二，血浆DNA中TM检测与EGFR-TKI的效果无关，但与EGFR突变类型、E19缺失和肿瘤进展有关。最后，二次活检只能在少部分PD患者中实现，且血浆DNA与二次活检的约有一半一致。
TM在40%的58例PD患者的血浆DNA中被检测到。激活性突变检出率为40%，TM或激活性突变单阳性的比例为62%，提示来源于肿瘤的DNA存在于至少62%的研究人群的外周血中。采用血浆DNA进行TM监测表明PD会增加TM检出率。第一个检出期主要集中于PD时和之后，且突变峰下的面积随着时间的增加而增加，这表明TM的结果反映了该病患群的临床过程。另外，PD患者接受过EGFR-TKI治疗者与无治疗史者相比，TM检出率更高，提示TM随着肿瘤进展出现于血浆中。PD前TM被散发检测到时，通过突变曲线下的面积计算得到的TM的量相对少。这些数据表明TM检测水平存在波动是由于其外周血中拷贝数低。
在临床中，二次活检TM阳性的肺癌患者比TM阴性的患者预后要好，提示TM阳性克隆可能侵袭性弱。然而，在一项回顾性研究中，我们报道了血浆DNA中TM阳性患者比阴性患者预后差。这一结果在本研究中得到了证实。本研究同样表明TM的检出率和数量随着肿瘤的进展而增加。另外，当新病灶，主要是远端转移灶出现时，TM更多地被检测到。TM和激活性突变的联合分析表明至少存在一种阳性的患者预后更差。综合上述所有结果，TM本身并不具有强烈的转移潜力，但是外周血中来自于肿瘤的DNA的出现与肿瘤进展，包括转移有关。来源于肿瘤的DNA在细胞坏死和/或凋亡，主要是坏死后释放入外周血中，且可能与肿瘤负荷、分期、细胞转换有关。
EGFR-TKI的效果，例如最佳反应、治疗持续、PFS，均与血浆中TM的检测无关。相反，血浆中TM更多地出现在吸烟者、男性以及E19缺失的病患中。这些结果表明血浆中TM的出现与肺癌的生物学特征有关，而非EGFR-TKI治疗状态。探索血浆和二次活检的一致性是本研究的第二个目的。然而，二次活检组织只从14%的患者中获取，且全部来自胸内区域。这表明二次活检很难取材，特别是从远端转移灶取材。尽管二次活检是评估EGFR-TKI获得性耐药机制的金标准，研究表明单个活检不能反映每个患者整个肿瘤的基因变异。最近有研究表明二次活检和液态活检包括血浆DNA和CTC的一致率为57-60%。基于全基因组测序结果，肿瘤DNA的体细胞突变约有21-55%可从血浆DNA中检测到。血浆DNA中原发灶的突变检出率比较低，转移灶的突变检出率相对高。这些结果表明血浆DNA中突变的检测可反映约一半的肿瘤中的突变，而且肿瘤间和肿瘤内的异质性可能是二次活检和液态活检突变状态不一致的原因。
血浆DNA监测TM能够帮助我们制定随后的治疗策略。为了确证血浆DNA可反映主要的基因变异，需要使用血浆DNA中TM检测作为标志物来研究TM抑制剂的抗癌作用。
信息来源：
Suoka-AraganN,KatakamiN,SatouchiM,tal.MonitoringEGFRTMwithplasmaDNAfromlungcancrpatintsinaprospctivobsrvationalstudy.CancrSci.Fb;(2):-7.
赞赏
人赞赏
北京哪有治白癜风的医院中科白癜风医院微博转载请注明：http://www.cbpxw.com/zlff/5981.html
