自体不成熟树突状细胞胸腔内注射医治化疗耐
导读百众源生物目的:视察体外扩增的不成熟树突状细胞(dendriticcells,DC)胸腔内注射对恶性胸腔积液的疗效和安全性。
方法:从6例对化疗耐药的恶性胸腔积液患者收集外周血单个核细胞，体外细胞因子引诱培养取得不成熟DC，每4周患者胸腔内注射DC()×个，连续3次为1疗程，视察医治后患者胸腔积液的变化及医治的不良反应，流式细胞仪检测胸水中T细胞、NK细胞亚群。
结果:整体疗效为:CR2例，PR1例，SD1例，PD2例，有效率为50%(3/6)，获益率(CR+PR+SD)为66.7%。2例CR均为肾癌患者，减缓时间达26周和周;3例肺癌患者中1例PR,1例SD及1例PD;1例恶性胸膜间皮瘤PD;医治中无严重不良反应产生。DC医治后6例患者胸水中的T细胞百分率均较医治前上升，但差异无统计学意义;NK细胞百分率较医治前明显上升(P0.05)。
结论:采取无抗原加载的自体不成熟DC胸腔内注射医治恶性胸腔积液的疗效肯定，可能主要是通过NK细胞介导，是一种安全、有效的医治方法。
作者：朱学军孔祥图范振芳等
恶性胸腔积液是恶性肿瘤的常见并发症之一，其生长迅速，常伴随胸闷、气急、心慌等症状，如不及时医治可造成患者呼吸循环功能障碍，严重者危及生命。口前恶性胸腔积液多采取化疗药物或生物免疫调节剂如沙培林、白介素2、香菇多糖等胸腔内注射医治，但较大一部分患者对上述医治原发耐药，胸腔积液难以消除。
树突状细胞(dendriticcells,DC)是体内功能最强大的抗原提呈细胞，可以激活细胞毒性T淋巴细胞及NK细胞，引诱抗肿瘤免疫效应。以往的DC疫苗策略大多采取体外负载肿瘤抗原的成熟DC，通过皮下注射或静脉注射方式回输患者实行免疫医治。本实验采取体外培养生成的、未予肿瘤抗原负载的患者自体不成熟DC胸腔内注射医治恶性胸腔积液，取得了良好的医治效果。
1.材料与方法
1.1一般资料
选择年10月至年10月经组织学和影象学确诊的6例晚期恶性实体肿瘤患者，临床分期均为Ⅳ期，经病理学和细胞学证实为恶性胸腔积液，并给予一种以上含铂类化疗药物胸腔灌注医治失败。
入组患者中，恶性胸膜间皮瘤1例，非小细胞肺癌3例，肾癌2例;其中男性3例，女性3例，年龄()岁，中位年龄69岁。肿瘤患者生活质量评分(KPS)40分，预计生存时间3个月，医治前血常规、心电图正常、肝肾功能指标均在1.5倍正常值范围。
所有患者和亲属在医治前均知情同意并签署知情同意书，并经医院伦理委员会论证通过。
1.2DC的制备与检测
采取以往建立的方法并做部份改进，简言之，运用血细胞分离机收集患者外周血，富集单个核细胞液ml，将收取的单个核细胞液经淋巴细胞分离液×g室温离心20min。
离心后吸取界面细胞，加人到30mlRPMI培养基中，×g离心10min，洗涤2遍，收取细胞。
将经离心洗涤的单个核细胞用Cellgro-DC无血清培养基配成4×个/ml的细胞悬液，种入ml无菌培养瓶，接种体积25ml。
将盛有细胞的培养瓶置37℃,5%CO2饱和湿度的培养箱中培养贴壁2h。将培养瓶取出，轻轻摇晃十数次，使非贴壁细胞悬起，去除悬浮细胞，再缓慢往瓶中加人30mlRPMI培养基，轻轻晃动洗去残留非贴壁细胞。
往保存贴壁细胞的培养瓶中加人30ml含重组人粒细胞1巨噬细胞生长因子(rhGM-CSF)0U/ml、重组人白细胞介素袱rhIL-4)U/ml的无血清DC培养基，置5%CO2,37℃饱和湿度的培养箱中继续培养。
培养至第3天，往培养瓶中补充30ml含rhGM-CSF0U/m1,rhIL-4U/ml的无血清DC培养基，继续培养4d，即取得DC。
每次换液后及细胞回输前进行细菌、真菌培养检测。
细胞回输前用FITC/PE标记的CD1a,CD83,HLA-DR,CD80,CD86,CD14,CD3,CD19抗体标记，流式细胞仪(Coulter,FC)检测DC的纯度。
1.3医治方案
患者在B超定位下肯定穿刺点，缓慢引流出胸腔积液ml，随后注人DC细胞悬液10m1,DC细胞数为()×个。
输注前给予异丙嗪25mg肌内注射预防过敏反应，记录每次医治后48h内有没有寒战、发热、过敏和心肺功能变化。
体温38.5℃不予处理，38.5℃给予塞来昔布0.2g口服退热，1周内避免使用激素。
随后医治同上，1次/4周，3次为1个疗程。
1.4视察指征及疗效判断标准
患者在医治前及每次医治结束后21d做B超或胸部X线片检查以判断疗效，参考WHO癌性积液疗效的判定标准:
完全减缓(CR)为积液完全消失且延续4周以上;
部份减缓(PR)为积液显著减少50%且延续4周以上;
稳定(SD)为积液减少50%，无增加趋势，症状部份减缓。
医治前及医治结束后进行KPS评分，同时检测血常规、肝肾功能及电解质。
患者在医治当天和医治结束后第7天，分别抽取胸水行流式细胞术检测胸水中T细胞、NK细胞亚群。
1.5统计学方法
采取SPSS15.0软件，计量数据以x±s表示，两组间比较采取配对资料t检验或单因素方差分析，以P0.05或P0.01表示差异有统计学意义。
2.结果
2.1患者外周血培养DCs的形态和表型
6例患者均成功体外扩增出半成熟DC，具有典型的树突状形态。流式细胞仪检测(图1)显示，表达CD1a的DC的比例为(56.23±6.75)%-(87.56±8.20)%,DC高表达CD80,CD86和HLA-DR，其中CD83+细胞5%，提示为不成熟DC;其余为表达CD14的单核细胞。
锥虫蓝拒染检测细胞活力均95%，无细菌、真菌污染。这些指标与国外报导的结果一致。
2.2疗效评价
所有患者均完成1个疗程的医治，医治结束后21d复查胸腔B超，整体疗效为:CR2例，PR1例，SD1例，PD2例，有效率为50%(3/6)，获益率(CR+PR+SD)为66.7%。
2例CR患者均为肾癌，且经患侧肾脏切除术后，其中1例患者伴随肝脏、颅内转移，DC医治前患侧胸腔大量血性胸水，每周需要抽取胸腔积液2次才能减缓胸闷、呼吸困难症状，
DC胸腔内注射1次后胸水即显著吸收，胸闷症状减缓，其后不再需要继续抽取胸腔积液，DC医治3次后胸腔积液完全消失，患者的减缓时间达周;
另外一例肾癌患者DC胸腔内注射1次后胸水也显著吸收，胸闷症状减缓，21d复查胸腔B超积液显著减少，减缓时间达26周。1例PR,1例SD及1例PD患者均为肺癌,3例患者医治后的KPS评分升高，1例稳定，2例下落。
2.3医治前后胸水中T、NK细胞亚群的变化
DC医治后，6例患者胸水中的CD3+,CD4+,CD8+T细胞百分率均较医治前上升，差异无统计学意义(P0.05);NK细胞(CD16+CD56+)百分率较医治前明显上升[(38.36±6.87)%vs(16.85±5.64)%,P0.O5]。
2.4不良反应
所有患者胸腔输注进程顺利，无过敏反应产生。其中3例患者在第1次输注4h后出现低热，体温最高38.0℃，未用特殊处理24h内均自行降至正常。所有患者均无局部疼痛、胸腔内炙烤感等其他不适，无严重不良反应产生。医治前后血常规、肝、肾功能及电解质均无明显变化。
3.讨论
以DC为基础的免疫医治基于以下原理:DC能够捕获肿瘤抗原提呈给T细胞，产生肿瘤特异性T细胞的免疫应对。
目前DC疫苗的策略是先体外培养取得DC，加载肿瘤抗原后通过皮下注射、静脉注射或淋巴结内注射等途径回输给患者。由于很大一部分肿瘤患者不能获得有效的肿瘤抗原，因此不能实行该医治或难以取得理想的临床疗效。
恶性体腔积液中存在大量的肿瘤细胞，部份肿瘤细胞由于生长环境的改变产生凋亡或坏死，这些凋亡的肿瘤细胞和坏死细胞碎片是良好的肿瘤抗原。
由于成熟DC抗原摄取能力大大下降，因此本实验通过体外培养取得不成熟DC，直接进行胸腔积液内注射，这些DC细胞活性好，能够辨认并提呈肿瘤抗原，引诱特异性抗肿瘤免疫应对。
大部分国内外临床试验中每次注射DC的细胞数为1×-5×个，本研究每次注射DC的数量为()×个，与多数临床试验中所采取的剂量大。结果表明，经过3次DC回输，医治恶性胸腔积液的有效率达50%，获益率为66.7%。其中2例肾癌患者DC胸腔内注射1次后胸水即显著吸收，DC医治3次后胸腔积液完全消失，患者的减缓时间达26周和周，医治后的KPS评分升高。
对DC医治前后胸腔积液中T细胞、NK细胞亚群的检测发现，DC医治后6例患者胸水中的T细胞百分率均较医治前上升，但差异无统计学意义(P0.05);NK细胞百分率较医治前明显上升，差异有统计学意义(P0.05)。
DC与NK细胞间的信号交谈(crosstalk)在驱动免疫反应中起到重要的作用，DC疫苗可以增强NK细胞的细胞毒活性，刺激NK细胞的细胞因子分泌IFN-y,TNF-a，和通过IL-12,IL-15,IL-18,CXCL9等增进NK细胞的迁移;反过来，活化的NK细胞能进一步反向作用于DC疫苗，增进体内DC的成熟。
有趣的是，近年来一些研究者报告了单独运用无抗原加载的DC(裸DC)进行体内接种，结果发现产生较强的抗肿瘤效果，能够以NK细胞依赖性的方式清除肿瘤;此外在部份DC疫苗研究的对比组实验中，也发现无抗原加载的DC能够引诱NK细胞介导的抗肿瘤免疫。
本研究中采取无抗原加载的DC胸腔内注射产生的抗肿瘤效应，也可能主要是通过NK细胞介导。
综上所述，不成熟DC免疫医治恶性胸腔积液是一种安全、有效的医治方法，有望在进一步的临床研究中运用。
来源：ChinJCancerBiother，，22(3):-.
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