摘要
简介：第三代表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)可克服因EGFR-TM二次突变引起的耐药，但针对TM突变所进行的二次活检可能会存在一些问题。
方法：通过ddPCR评估EGFR阳性非小细胞肺癌EGFR-TKI敏感突变及TM耐药突变。
结果：29个中心参与WJOGLTR研究，.11~.3期间共收集名患者。收集所有EGFR-TKI耐药患者的血浆样本，同时收集41名患者的肿瘤组织或恶性胸腔积液或腹水。名（46.2%）患者检测出TKI敏感突变，75名（28.8%）患者检测出TM突变。血浆中TKI敏感突变阳性患者TM突变检出率为56.7%。通过ddPCR分别对41名患者的血浆及相应的组织样本或恶性液体样本进行检测，TKI敏感突变检出一致率78.0%，TM检出一致率65.9%。
结论：靶向治疗中，ddPCR对血浆中cfDNA进行基因突变检测是一种可行的方法。
结果
预筛选临界值
为了优化EGFR基因型分析的特异性，我们通过与10名健康志愿者的血浆cfDNA，正常基因组DNA，EGFR阴性石蜡样本的对比确定了血浆cfDNA、胸腔积液／腹水、FFPE的临界值。10名健康志愿者的血浆cfDNA或正常基因组DNA没有检测到TM、LR、E-Adl、LQ、GX突变，因此对于血浆样本，EGFR突变的临界值设为0.15copis/uL。胸腔积液或腹水与血浆样本临界值相同（0.15copis/uL）。FFPE样本的DNA易降解，在对21名非小细胞肺癌EGFR阴性患者的TM、LR、E-Adl、LQ、GX突变拷贝数的测定值±SD评估后，设定TM的临界值为1.11copis/uL，LR为0.2copis/uL，E-A为dl0.3copis/uL，LQ为0.15copis/uL，GX为1.8copis/uL。
患者特征
.11.4~.3.13日本29家机构共招募名EGFR-TKIs耐药的阳性患者（表1）。名（70.0%）女性，名（71.5%）不吸烟者，平均年龄68岁（36~90），78.8%为Ⅲb或Ⅳ期患者，95.8%ECOG评分0~2，名（73.5%）患者接受EGFR-TKI一线治疗。FFPE样本检测结果显示名（48.8%）患者19外显子缺失，名（46.9%）21外显子错位突变（LR/LQ），4名18外显子GX突变。78.8%的患者接受吉非替尼一线治疗。58.8%的血浆样本来自一线EGFR-TKI治疗的患者。
表1非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药患者特征
血浆EGFR-TKI敏感突变或TM突变与临床病理特征的相关性
收集名EGFR-TKIs获得性耐药患者的血浆，其中例为（46.2%）TKI敏感突变，75例为（28.8%）TM突变（表1）。例TKI敏感突变中68例（56.7%）伴随TM突变。另7例患者仅存在TM突变。
本研究表明血浆EGFR-TKI敏感突变及TM突变检出率与性别、吸烟与否、EGFR突变型、ECOG评分、肿瘤分期、一线治疗方案、首次EGFR-TKI药物的选择均无明显相关性。而与化疗次数有关，接受过化疗方案的较没有接收过的要高（TKI敏感突变61.7%vs38.3%，P=0.；TM突变66.7%vs33.3%，P=0.）。
EGFR-TKI敏感突变/TM突变的二次活检
我们从EGFR-TKIs获得性耐药患者中取18例肿瘤组织，23例胸水/腹水样本（表2）。ddPCR分析表明41例样本中33例（80.5%）存在敏感突变，31例（75.6%）为TM突变，近20%的样本未检测到突变。因此我们对比分析了初诊样本及其获得性耐药后样本的基因突变情况，15例LR突变样本中14例也检测到相同的突变，26例19外显子缺失样本中仅检测出19例。
表2EGFR-TKIs耐药后组织或恶性液体TKI敏感突变/TM突变检测
血浆和肿瘤样本EGFR突变检测的一致性
41名EGFR-TKI获得性耐药患者的肿瘤组织/恶性液体样本的研究表明，23例液体样本中19例（82.6%）检出TKI敏感突变，18例肿瘤组织中14例（77.8%）检出TKI敏感突变，TM的检出率分别是87.0%，61.1%（表2）。41例血浆样本，78.0%（32/41）（敏感性75.8%，特异性87.5%）存在TKI敏感突变，65.9%（27/41）（敏感性64.5%，特异性70.0%）存在TM突变。（表3）
表3：EGFR-TKI耐药后血浆和活检样本TKI敏感突变/TM突变检测的相关性
讨论
我们就ddPCR对接受EGFR-TKIs治疗的非小细胞肺癌EGFR突变阳性患者的血浆TM突变检测的敏感性及定量分析进行了前瞻性评估。例血浆样本成功提取DNA并进行基因分型（成功率%），14天内临床医生接受到结果。结果表明ddPCR是一种较为合适的用于血浆EGFR-TM突变的检测方法。
接受EGFR-TKIs治疗的患者，其血浆TM的检出率为28.8%，而在之前的研究报道为43%。存在差异的原因可能是血浆收集的时间不同，此外本研究并没有考虑是否接受过化疗。我们发现接受过化疗的患者较未接受过的TM突变率明显偏高。先前的研究仅限于EGFR-TKI治疗期间疾病进展后续治疗之前的血浆样本。此外，本研究73.5%的患者接受了EGFR-TKIs一线治疗，而之前的研究69.6%的患者在二线或之后的治疗中才接受EGFR-TKIs。有研究表明，在非小细胞肺癌阳性人群中肿瘤越大，个体TM突变率越高。肿瘤越大且多线治疗的患者，越容易检测到TM突变。因此在疾病进展后接受EGFR-TKIs治疗的患者，血浆中越容易检测到TM突变。
EGFR-TKI敏感突变阳性患者耐药后，其血浆内TM的检出率为56.7%，与组织检出率（约50%）相似。先前的研究表明EGFR-TKIs耐药后TM在血浆和肿瘤组织的检出一致率为64%，本研究中的一致率为65.9%。因此通过数字PCR检测TKI敏感突变阳性患者的血浆cfDNA-TM突变是一种可行的方法。此外该研究中28.1%（73/）的患者是胸外转移灶包括脑转移、骨转移、肾上腺转移。73名患者的TKI敏感突变和TM突变血浆检出率分别为61.6%，46.6%，因此对于活检组织或恶性液体取样较困难的患者，通过ddPCR检测血浆cfDNA中EGFR-TKIs或其他靶向药物治疗期间的耐药突变，是一种极具潜力且可行的方法。
信息来源：
TakayukiTakahama1,KazukoSakai,MasayukiTakda,tal.DtctionofthTMmutationofEGFRinplasmaofadvancdnon–smallclllungcancrpatintswithacquirdrsistanctotyrosinkinasinhibitors(WstJapanoncologygroupLTRstudy).Oncotargt,.
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