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液体活检（liquidbiopsy）是当下炙手可热的研究方向，相比传统的病理活检，其最大的优势就是样本易得，比如最常见的血液，腹腔胸腔积液，再到无创诊断的尿液...那么顺应潮流的策略就是，在常规病理组织的生信的同时，想想是否可以利用其它来源，今天讲的这篇文献是想告诉大家，可能同一个技术路线，在不同的组织来源下，是不同的故事，如果再加一个和金标准的对比和验证，那这个故事就丰满了。在这篇文献中，作者分析的SNV，拷贝数并不新鲜，但来源是来自胸水，同时进行了多组织的比对，和验证，虽然文章分数不是很高，但技术路线值得大家借鉴。
研究背景：
肺癌是恶性肿瘤中发病率和死亡率最高的疾病之一，每年造成全球约38万人死亡。靶向深度测序是一种低成本且高度灵敏的突变检测方法。靶向治疗是基于特定的基因改变。现有研究已使用各种不同样本类型来确定基因突变，但尚未进行系统比较。
复发性恶性胸腔积液（PE）活组织检查的侵入性较小，因此可以更频繁地获得。但只有传统技术如荧光原位杂交，PCR或ARMS，还有焦磷酸测序已被用于分析胸腔积液上清液（PES）和胸腔积液细胞（PEC）样品。需要采用具有高通量和灵敏度的新技术来评估胸腔积液的临床价值。
大多数肺癌基因组研究都是在肿瘤组织样本（FFPE或新鲜冷冻组织）上进行的。由于存在瘤内和瘤间异质性，这些研究未能提供整体突变模式。相反，PE可以克服这些限制并揭示代表肺中不同肿瘤的组合突变模式。血浆由于其全身循环的特性，可携带来自更多不同位点的突变，例如远处转移。
除单核苷酸突变（SNV）外，拷贝数变异是癌症基因组的主要染色体畸变之一。无创性血液提取允许评估cfDNA中的SNV。但分析cfDNA的CNV是具有挑战性的，因为该来源通常是高度片段化的，并且这种片段化与细胞凋亡和核小体占据相关。测序分析中的read深度不仅可以反映肿瘤细胞中的拷贝数变异，还可以反映核小体占据（被组蛋白八聚体占据的给定的DNA区域）。cfDNA可以非侵入性地获得并可用于检测CNV，将极大地有益于精准医学。
本文评估了肺癌患者不同样本位点的癌症相关基因的突变情况。使用深度测序比较来自六个样品来源的体细胞突变，包括PES，PEC，福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织，白细胞（WBC），口腔上皮细胞（OEC）和血浆。靶向基因组由48个癌症相关基因的全长组成。还在PEC样品中鉴定了拷贝数变体。该研究证明了每种样本类型对于肺癌个性化医疗的独特价值，并将有益于液体活检的临床实施。
结果：
在96％（53/55）的患者和83％（40/48）的所选基因中检测到突变。每种样品类型都表现出特有的突变模式。正如预期的那样，TP53是受影响最大的序列（54.5％的患者），然而其次是NOTCH（36％，所有样本类型）。患者样本中EGFR的突变频率为32.7％，KRAS为0.9％。这种高EGFR/低KRAS频率与亚洲血统的其他TCGA队列一致，但不同于KRAS是更主要突变的高加索人群。另外，66％（3/47）的PEC样品在至少一个基因中具有拷贝数变异（CNVs）。与大多数基因拷贝数的缺失和扩增不同，本文在2％的患者中发现NOTCH缺失，且未观察到扩增。基于相对普遍的SNVs和CNVs，我们将肺癌患者分为SNV主导，CNV主导和两者协同主导组。
结论：本文的结果证实了先前的报道，EGFR突变在中国肺癌患者中比KRAS更普遍。NOTCH基因突变比先前报道的更常见，并揭示了NOTCH修饰在肿瘤转移中的作用。此外，来自恶性胸腔积液细胞沉积物的遗传物质可能是一种非侵入性的方式来鉴定CNV并参与治疗方案的确定。
材料和方法
患者数据：
样本来自中国大连的55名中国肺癌患者。所有患者均在IV期被诊断出并且患有胸部转移。总共采集来自40名患的PES，47名患者的PEC和0名患者的血浆。在可能的情况下，对FFPE肿瘤组织，外周血和OEC进行取样。
DNA提取：
对PE和血浆样品离心，分别收集无PES和PEC。使用TIANampGenomicDNAKit从OEC，PEC和WBC中提取基因组DNA。使用QIAampCirculatingNucleicAcidKit（QIAGEN）从PES和血浆中提取无cfDNA。使用QIAampDNAFFPETissueKit（QIAGEN）从石蜡包埋的肿瘤组织样品中提取基因组DNA。
文库构建：
使用多重PCR扩增48个肿瘤相关基因的外显子区域；样本量：20ngcfDNA；仪器：Veriti96-WellThermalCycler（AppliedBiosystems）。使用High-Fidelity2×PCRMasterMix进行PCR富集。
突变分析：
使用具有高灵敏度和低错误率的突变分析软件PlasmaMutationDetector进行突变检测。
突变负荷分析：
肿瘤突变负荷定义为非沉默突变的数量除以以兆碱基表示的靶区域大小（79,bp）。在评估特定基因突变与患者突变负荷的关联时，我们通过从整体突变负荷中减去目标基因中的突变来纠正患者突变负荷。使用t检验计算具有或不具有目的基因突变的两组患者之间的P值，显著性设定为P.05。
CNV分析：
使用WBC作为对照，通过多标准化工具ONCONCV-6.6在PEC样本中检测拷贝数。四种类型的拷贝数变异定义如下：扩增（拷贝数≥4），增加（拷贝数2），丢失（拷贝数0）和缺失（拷贝数在0和2之间）。使用Apriori算法确定CNVs和SNPs的共突变。
结果
.靶向深度测序检测突变谱：总共有来自55名患者的53个样本可用于48-肿瘤基因组的分析。分析了不同类型的样品，包括WBC（n=6），PES（n=50），PEC（n=57），OEC（n=4），血浆（n=0）和FFPE（n=6）。在所有样品中共检测到个突变。在96％（53/55）的患者和83％（40/48）的所选基因中检测到突变。虽然非同义SNV是最主要的突变类型，但一些基因表现出明显的突变特征。在TP53基因（26％患者）和KDR基因（8％;下图）中观察到高比例的终止子获得(stopgain)突变。值得注意的是高比例的同义突变和内含子突变是AKT（00％患者）和NOTCH（79％）（下图），表明这两个基因可能通过不依赖于氨基酸序列变化的通路参与肿瘤发生过程。
Fig.肺癌患者突变谱
2.突变频率，热点突变和突变负荷：.非沉默突变的频率如图2A所示。前八个突变基因是TP53（在54.5％患者中），NOTCH（36.4％），EGFR（32.7％），KDR（27.3％），PDGFRA（20.0％），ERBB2（4.5％），JAK2（4.5％），和ALK（2.7％）。2.45％（25/55）的患者具有COSMIC数据库定义的已知热点突变（图2B）。3.检测药物靶基因的突变（n=3）（图2C），其中9名患者具有EGFRp.G79A突变，6名患者具有EGFRp.RH突变，5名患者具有EGFRp.IL。4.相同癌症类型的患者通常携带不同数量的突变，并且已经显示这种可变性（突变负荷）与免疫疗法的效果密切相关。突变负荷范围为5.8至32个突变/mb，平均值为47个突变/mb。标准偏差达到34.7个突变/mb，几乎是平均值的0.74倍。为了检查患者突变负荷是否随着特定基因的改变而变化，本文根据特定基因中是否存在突变将患者分为两组（图2D）。可以观察到，基因MET，NOTCH，KDR，KRAS，APC或BRAF中的突变的存在对给定患者的总突变负荷具有显着影响（P.05）（图2D）。5.对于基因TP53或EGFR未观察到这种关联（图2E）。6.具有KRAS突变的患者（n=5）具有6个突变/mb，远高于没有KRAS突变的患者（n=47）（45个突变/mb，P=.）。7.在KDR基因中观察到更显着的差异，其中KDR突变患者中有68个突变/mb，而没有KDR突变的患者中有34个突变/mb（P=2.0×0-4）。8.通路分析表明这六个基因与内皮细胞趋化性和细胞死亡途径的调节有关。
Fig2.突变频率排名前8的基因
3.比较OEC，肿瘤组织，胸膜和血浆的突变：.本文分析了每种样品类型中48癌症基因的突变频率。OEC被取样作为非癌源（4名患者），其中7名患者发现了体细胞突变。OEC中突变频率最高的基因是TP53（图3A）。2.OEC和WBC的非癌样品聚集在一起并表现出最低的突变频率。3.大多数基因（n=9）在肿瘤组织中表现出最高的突变频率，其次是PE（n=4）和血浆（n=9）（图3B），这与每个病人中，肿瘤组织具有最高突变个数的观察结果一致。4.但有些基因，包括NOTCH，EGFR，KDR，MET和BRAF，表现出不同的结果;它们在血浆中达到了突变频率的顶峰（图3A，C）。尤其是NOTCH，其中70％的血浆样品至少表现出一种突变，突出了检测癌症突变时血浆的独特价值。该频率远高于我们肿瘤样本中观察到的20％的频率，还有在癌症基因组图谱中报道的8％。然而，对于肿瘤组织中较低的突变频率和cfDNA中较高的突变频率的结果，本文报道的NOTCH突变频率与其他癌症队列研究一致。
Fig3.不同样本类型的热图和突变频率
4.本文对不同样品类型的NOTCH突变进行了进一步分析（图4）。在PE（n=28），血浆（n=7），FFPE（n=6）和OEC（n=7）的23名患者中总共检测到68个突变。.在FFPE和OEC中，突变分布是随机的;没有一个突变发生在一个以上的病人。2.相反，PE和血浆中聚集的趋势是明显的。在PE中，超过两名患者发生了五次突变。血浆突变主要集中在三个位点，NOTCHPP，D85D和AT（图4）。3.血浆中的五个突变中的每一个也在PE中突变，但在FFPE或OEC中没有突变，表明这两种流体衍生的DNA的紧密起源（图4）。4.一些突变发生在NOTCH的重要功能域中，例如钙结合EGF结构域，EGF样结构域，LNR结构域，锚蛋白重复序列和PEST结构域（图4），可能损害NOTCH活性。
Fig4.不同样本来源之间NOTCH突变的示意图
5.PEC样本中的CNV检测：.本文在66％（3/47）的PEC样品中发现了拷贝数变异（图5A）。拷贝数变异的前2个基因是SMAD4（在32％患者中），SRC（32％），FGFR（30％），CDKN2A（30％），FGFR2（28％），RB（28％），STK（28）％），EGFR（26％），JAK2（26％），RET（26％），PTEN（26％）和GNAS（26％）。2.拷贝数丢失比拷贝数增加更普遍，但有些基因，例如NPM，EGFR，MET，SMO，BRAF，PI3KCA，CSFR和ERBB2，主要表现出拷贝数增加，且EGFR基因只有拷贝数扩增。3.与肿瘤抑制基因数据库（TSGene2.0）的比较表明，上述8个基因是已知的致癌基因，因此本研究中致癌基因的拷贝数获得（gain）显着增加（P=0.）。
4.在至少一名患者中将8种基因EGFR，FGFR，GNAS，PI3KCA，MET，SMARCB，KRAS和CSFR鉴定为AMPL（图5A）。5.一些基因的CNV显示出共现的趋势（图5B）。参与“细胞死亡的负调节”，MET，SMO和BRAF的三个基因同时显示7名患者的拷贝数增加（图5B）。相反，由GSEA鉴定的参与“外源性细胞凋亡信号传导途径的正调节”，FGFR2，RET和PTEN的三种基因同时显示7名患者的拷贝数丢失（图5C）。这些基因的同时丧失可能增加肿瘤细胞对细胞凋亡的抵抗力。6.本文还观察到参与“细胞增殖的负调节”的八个基因中拷贝数变异方向的一致性（图5D）。7.通过组合CNV和SNP，本文鉴定了一种独特的基因组，可能协同保护肿瘤细胞免于细胞周期停滞（图5E）。8.分别在7％，2％，30％，28％，2％和9％的患者中检测到出TP53，NOTCH，CDKN2A，RB，FLT3和ABL的拷贝数丢失。同时，在TP53（在64％患者中），NOTCH（38％），CDKN2A（4％），RB（4％），FLT（34％）和ABL（2%）中检测到非同义突变。除了CDKN2A之外，所有其他五种基因都表现出CNV和SNV的一些层面的共存，尤其是TP53和NOTCH，其中分别在7％和％的患者中鉴定出共存（图5E）。9.CNV畸变在SRC和STK等基因中占主导地位，而SNP畸变在KDR和PDGFRA中占主导地位。对于大多数基因，鉴定了CNV和突变的共存，最常见的是TP53，EGFR和NOTCH（图6A）。0.基于CNV或SNP的相对数量，可以将患者分为CNV主导的，SNV主导的或两者共主导的三组（图6B）。.综上表明单单拷贝数异常，或CNV+SNP可能是肺癌进展的重要组成部分。
Fig5.拷贝数变异和相关的生物通路图谱
Fig6.47名患者中48种基因的CNV和mutation（SNV）的共存情况
参考文献：
LiaoY,MaZ,ZhangY,etal.TargeteddeepsequencingfrommultiplesourcesdemonstratesincreasedNOTCHalterationsinlungcancerpatientplasma[J].Cancermedicine,.
生信解读掠影：
解读一篇9分SCI生信文章：顺应潮流才能一蹴而就
这篇文章，没做半点实验怎么就发顶级期刊Immunity了？！
当生信扯上免疫，原来文章上5分是这么简单......
思路清奇！这篇玩到lan的套路文章是如何上5分的
如何从甲基化入手，轻松整篇预后标志物的文章？
生信SCI如何入门火爆的环状RNA领域？
啥？基因还有“假”的！然后5分的SCI就这么到手啦！？
这篇Cell子刊文章能不能参照着做？能！
经典套路解析：胃癌亚型预后分析（CCR，IF=0.9)）
一篇文献一个技术路线：火热的免疫
一文献一技术路线：人工智能+肿瘤预后
一文献一技术路线：最火免疫+“双拼”
一文献一技术路线：不是癌的cancer：泛癌（Pan-Cancer）
一文献一技术路线：“免疫双拼”升级版
一文一路线：“粗暴”的多组学
一文献一技术路线：“明星分子”的机制研究
一文献一技术路线：另辟蹊径，挖掘“小癌种”
一文献一技术路线：病理形态学+蛋白组学
课题合作！
......
师兄嘱托：
生信学习需要持之以恒，大家可以到目前国内最大的生信学习社区（
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